XFELと電子顕微鏡による低分子有機化合物の結晶構造解析
－2線源の特性を生かし、水素原子と電荷に関する情報を取得－

2023年3月21日
理化学研究所
東北大学
高輝度光科学研究センター
科学技術振興機構

理化学研究所（理研）放射光科学研究センター利用技術開拓研究部門生体機構研究グループの高場圭章基礎科学特別研究員、利用システム開発研究部門SACLAビームライン基盤グループイメージング開発チームの眞木さおり研究員、生体機構研究グループの米倉功治グループディレクター（理研科技ハブ産連本部バトンゾーン研究推進プログラム理研-JEOL連携センター次世代電子顕微鏡開発連携ユニットユニットリーダー、東北大学多元物質科学研究所教授）、SACLAビームライン基盤グループビームライン開発チームの井上伊知郎研究員、高輝度光科学研究センターXFEL利用研究推進室の登野健介チームリーダー、理研同センター物理・化学系ビームライン基盤グループの矢橋牧名グループディレクター、同センターの石川哲也センター長らの共同研究グループは、X線自由電子レーザー（XFEL）[1]を用いて、低分子有機化合物の微小結晶から水素原子を含む詳しい構造解析が可能なことを明らかにし、XFELと電子顕微鏡の相補利用の有用性を示しました。 　本研究成果は、有機化合物の立体構造、化学的性質、機能のより詳しい理解を進め、創薬や材料開発に役立つと期待できます。 　有機合成化学、薬学、材料科学などの分野では大きな結晶が得られない化合物が多いため、小さな結晶の構造解析が重要です。電子線はX線に比べて試料に数万倍も強く散乱されるため、微小結晶の構造解析に利用されています。 　今回、共同研究グループはXFEL施設「SACLA」[2]を用いた高効率な解析技術を開発し、ローダミン6Gという有機蛍光分子の詳細な構造を決定することに成功しました。この構造と電子顕微鏡を用いて得られた構造を比較したところ、化学結合の種類によって変わる水素原子の結合距離を判別し、X線と電子線の両線源で異なる散乱体を識別する精度を持つことが分かりました。また、原子座標[3]の信頼性はXFELの方が高く、一方で電子線は電荷に対して高い感度を持つことも明らかになりました。これにより、分子機能と直結する構造特性を観察できることが示されました。 　本研究は、科学雑誌『Nature Chemistry』オンライン版（3月20日付：日本時間3月21日）に掲載されました。 　 論文情報 ＜タイトル＞ Structural resolution of a small organic molecule by serial X-ray free-electron laser and electron crystallography ＜著者名＞ Kiyofumi Takaba, Saori Maki-Yonekura, Ichiro Inoue, Kensuke Tono, Tasuku Hamaguchi, Keisuke Kawakami, Hisashi Naitow, Tetsuya Ishikawa, Makina Yabashi and Koji Yonekura ＜雑誌＞ Nature Chemistry ＜DOI＞ 10.1038/s41557-023-01162-9

背景
　有機合成化学、薬学、材料科学の分野において、低分子有機化合物の結晶構造解析をする場合、従来のX線回折^[4]に適した数百マイクロメートル（μm、1μmは100万分の1メートル）以上の大きさの結晶を形成することは困難な場合が多いことから、微小結晶構造解析が注目されています。
　構造決定に必要な試料サイズを決める散乱断面積（試料に散乱される強さ）は、X線と電子線では大きく異なり、電子線はX線に比べて数万倍も大きいことが知られています。この性質を利用して、X線回折では小さすぎる、厚さ数百ナノメートル（nm、1nmは10億分の1メートル）以下の結晶の構造を、電子顕微鏡を用いた電子線3次元結晶構造解析法^[5]により、原子レベルの空間分解能^[6]で決定できるようになりました。
　一方、XFELは高強度かつ超高速のX線パルスを発生させることができます。1パルスで試料破壊前のデータ収集が可能であり、電子線の試料の散乱断面積との大きな差を補うことができると考えられます。XFELパルスを用いた連続結晶X線構造解析（SX）^[7]は、多数の微小結晶から回折パターンを記録します。SXはこれまで主にタンパク質結晶に適用されてきましたが、タンパク質よりも分子量が小さい低分子有機化合物の結晶では、カメラ1フレーム当たりの回折スポットの数が少なく、データ処理が難しいという課題がありました。
　有機分子構造において、水素原子は分子内・分子間で幅広い非共有結合を形成することで、さまざまな局所的な相互作用に寄与し、分子の性質、機能に大きな影響を及ぼします。しかし、X線や電子線で得られる水素原子からの信号は弱いため、1オングストローム（Å、1Åは100億分の1メートル）よりも小さい原子を分離できる分解能での高精度な構造解析が不可欠となります。
　また、X線は原子核の周りの電子によって、電子線は原子の周りのクーロンポテンシャル^[8]によってそれぞれ散乱されます。そのため、両線源で得られた構造を詳しく比較し、実験的信頼性を評価する必要がありました。
　本研究では、これらの課題解決のための技術開発に取り組みました。

　

研究手法と成果
　共同研究グループはまず、X線の散乱が少ないポリイミド製の試料支持板（4mm×4mm）を新しくデザインし、その表面にローダミン6Gという有機蛍光分子（低分子有機化合物）の微小結晶を散布しました。試料支持板を高速で動かしながら、径1μm程度に集光した15keVの高エネルギーXFELパルスを、10μmの間隔で微小結晶に照射し、X線回折パターンを大量に集めました（図1）。

　

　XFELと並行し、理研が所有する高精度クライオ電子顕微鏡^[9]を用いて、ローダミン6Gの電子回折パターンを集め、構造を解析しました。XFELで得られた回折データの処理には、電子線で得られた結晶の繰り返し周期に関する情報を与えました。これにより、前記のカメラ1フレーム当たりの回折スポットの数が少なくデータ処理が難しいという課題を克服し、既存方法^注1）に比べ約20倍高効率に処理できました。その結果、0.82Åの空間分解能でローダミン6Gの構造をXFELから決定することに成功しました。
　両手法で得られた構造は、水素原子を可視化できる高い精度を持っていました。化学結合の種類によって、水素原子と結合相手の原子との距離は異なります。
　2つの構造を比較したところ、どちらの方法でも水素原子の結合距離を判別する精度を持つことが分かりました。一つしかない水素原子の電子は、結合している炭素原子や窒素原子の方に引き寄せられます。従って、原子核の周りの電子のみに散乱されるX線では、水素原子との結合距離が短く計測されるのに対して、電子線が散乱されるクーロンポテンシャルでは原子核の寄与も反映されるため、水素原子との結合距離はX線よりも長く計測され、水素原子核により近い位置になることが予測されていました。今回のXFELと電子顕微鏡の詳細構造はそれを実証する結果となりました（図2）。

　

注1）E. Schriber et al., Chemical crystallography by serial femtosecond X-ray diffraction. Nature 601, 360–365 (2022).

　電子線の複雑な散乱過程を完全に説明することは難しいのに対して、X線では透過性が強く散乱過程をよりシンプルに説明できます。これを反映し、原子座標の信頼性はXFELの方が高いことが示されました。一方、電子線は電荷に対して高い感度を持つことが分かり（図3）、さらに、X線との比較から、各原子の電子の分布を可視化できる可能性も示されました。

今後の期待
　本研究により、高強度かつ高速なXFELパルスを用いて、低分子有機化合物の微小結晶から詳細な構造を決定することが可能になりました。さらに、XFELと電子顕微鏡で有機化合物の異なる特徴が明らかになりました。
　今回開発した手法は、微小結晶を用いることができ、特別な試料の処理を必要としないため、実用的です。また、分子機能と相関の高い構造特性を観察できることから、今後、より機能性の高い薬剤・材料分子のデザイン・開発が期待できます。

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補足説明

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共同研究グループ

理化学研究所　放射光科学研究センター
				センター長		石川哲也	（イシカワ・テツヤ）
	利用技術開拓研究部門
		生体機構研究グループ
				基礎科学特別研究員		高場圭章	（タカバ・キヨフミ）
				グループディレクター		米倉功治	（ヨネクラ・コウジ）
				（科技ハブ産連本部　バトンゾーン研究推進プログラム
				理研-JEOL連携センター　次世代電子顕微鏡開発連携ユニット
				ユニットリーダー、東北大学　多元物質科学研究所　教授）
				研究員（研究当時）		浜口　祐	（ハマグチ・タスク）
				研究員		川上恵典	（カワカミ・ケイスケ）
				先任研究員		内藤久志	（ナイトウ・ヒサシ）
	利用システム開発研究部門
		SACLAビームライン基盤グループ
			イメージング開発チーム
				研究員		眞木さおり	（マキ・サオリ）
			ビームライン開発チーム
				研究員		井上伊知郎	（イノウエ・イチロウ）
		物理・化学系ビームライン基盤グループ
				グループディレクター		矢橋牧名	（ヤバシ・マキナ）
高輝度光科学研究センター　XFEL利用研究推進室
				チームリーダー		登野健介	（トノ・ケンスケ）

研究支援
　本研究は、日本学術振興会（JSPS）科学研究費助成事業若手研究「電子線を利用したタンパク質の分子内電荷の決定（研究代表者：高場圭章、20K15764）」、科学技術振興機構（JST）未来社会創造事業探索加速型「微小結晶構造の自動・高精度電子線解析（研究代表者：米倉功治、JPMJMI20G5）」、同戦略的創造推進事業CREST「実験・計算・データ科学融合による塗布型電子材料の開発（JPMJCR18J2）」、日本医療研究開発機構（AMED）医療研究開発革新基盤創成事業（CiCLE）などの助成を受けて行われました。

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