AI制御によるクライオEMの自動測定システムを開発
－AIに管理を任せてデータ測定を楽に－

2021年9月17日
理化学研究所
東北大学

理化学研究所（理研）放射光科学研究センター利用技術開拓研究部門生体機構研究グループの米倉功治グループディレクター（東北大学多元物質科学研究所 教授）、内藤久志先任研究員、浜口祐研究員、高場圭章特別研究員、XFEL研究開発部門ビームライン研究開発グループイメージング開発チームの眞木さおり研究員の研究チームは、人工知能（AI）制御によるクライオ電子顕微鏡（クライオEM）[1]の画像データの自動測定システムを開発しました。 　試料の結晶作製が必要ない「単粒子解析[2]」では、個々の分子が写った多数の画像を撮影すること、微小結晶を用いる「電子線三次元結晶構造解析[3]」では、回折パターン[4]を記録することで、タンパク質などの立体構造を決定します。後者は薬剤や機能性材料の詳細な構造決定にも用いられています。どちらの手法も半自動で測定できるものの、データ取得に失敗する場合もあり、解決すべき課題として残されていました。 　今回、研究チームは、AIを利用してクライオEMのデータ測定を制御するソフトウェア「yoneoLocr」を開発しました。まず、分子の画像撮影と電子回折パターン測定に必要となる画像データを、ディープラーニング[5]で機械学習させました。次に、学習結果をデータ測定時にリアルタイムで利用できる一連のシステムを開発し、理研の高性能クライオEMで運用しました。その結果、両手法において、データ取得の失敗は大幅に減少し、完全自動での測定が可能になりました。 　本研究は、本研究は、オンライン科学雑誌『Communications Biology』（9月7日付）に掲載されました。 　 　 論文情報 ＜タイトル＞ Machine learning-based real-time object locator/evaluator for cryo-EM data collection ＜著者名＞ Koji Yonekura, Saori Maki-Yonekura, Hisashi Naitow, Tasuku Hamaguchi and Kiyofumi Takaba ＜雑誌＞ Communications Biology ＜DOI＞ 10.1038/s42003-021-02577-1

研究支援
　本研究は、科学技術振興機構（JST）未来社会創造事業（課題番号：JPMJMI20G5）、日本医療研究開発機構(AMED) 医療研究開発革新基盤創成事業 (CiCLE)、JST戦略的創造研究推進事業CREST（課題番号：JPMJCR18J2）などの助成を受けて行われました。

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背景　
　クライオ電子顕微鏡（クライオEM）の「単粒子解析」では、試料の結晶作製を必要とせず、個々の分子が写った多数の画像を撮影することで、タンパク質などの立体構造を決定します。具体的には、カーボン膜に規則的に並んだ直径1～2マイクロメートル（µm、1µmは1,000分の1mm）の多数の穴（図1）の中の薄い氷に、試料のタンパク質を包埋し、液体窒素（-196℃）冷却下で観察します。このとき、構造解析に用いる高い倍率（5万～10万倍）で観察しながら、撮影位置を試料の場所に合わせると、強い電子線の影響でタンパク質は破壊されてしまいます。
　そこで、中程度の倍率（1,000～1万倍）で撮影した像を用いて、電子顕微鏡の試料ステージの位置を調整します。この位置合わせには、事前に用意した参照像との相関（どのくらい似ているかを数値で評価する）を計算するのが一般的な手順です。しかし、氷が厚く像のコントラストが悪かったり、氷の塊やカーボン膜の切れ端などの大きなゴミ（コンタミネーション）が写り込んだりすると、参照像との相関が悪くなり、位置合わせが正しくできず、撮影は失敗してしまいます。
　一方、「電子線三次元結晶構造解析」では、薬剤や機能性材料などの分子の非常に微小な結晶から、原子の配置を詳細に決定できます^注1)。この手法では、クライオEMを用いて試料の結晶の回折パターンを多数測定しますが、単粒子解析と同様に位置合わせの問題が生じます。加えて、事前に回折パターンを得られる結晶であるか否かが判別できず、測定に適した結晶を探すのに半日以上要する場合もあるというのが課題でした。
　そこで研究チームは、クライオEMを用いた測定の制御に人工知能（AI）の活用を試みました。

注1） 2015年2月23日プレスリリース「微小で薄いタンパク質結晶の電子線構造解析」
　http://www.riken.jp/pr/press/2015/20150223_1/

研究手法と成果
　研究チームは、ディープラーニングを用いたリアルタイムでの画像検知に定評のある、YOLO（You Only Look Once）というオープンソース^[6]ソフトウェアを利用しました。
　まず、単粒子解析では、実際の撮影時に集められたカーボン膜の穴の多数の写真から、その特徴をYOLOにディープラーニングで機械学習させました。そして、この学習データで検知された膜穴の場所から、電子顕微鏡の試料ステージ位置を調整するシステムを開発しました。
　最新の撮影技術では、一度ステージの位置を合わせると、その周囲3×3や5×5の複数の膜穴から、電子ビームを偏向させることで画像データを取得します（図1）。こうすることで、安定性が悪く、動きの遅いステージでの機械的な移動を最小限に抑え、良質な画像データを高速に取得できます。ただし、はじめのステージ位置の調整に失敗すると、図1の例では25枚、場合によっては100枚以上の失敗した画像データが貯まってしまいます。

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　開発したシステムを使うことで、撮影の失敗はなくなりました。穴の検出にかかる時間は0.1秒以下になり、視認性の悪い場合でも、正確に試料ステージの位置合わせができるようになりました（図2）。これにより、理研の高性能クライオEM^注2）において、高分解能^[7]かつ高精度でのタンパク質の単粒子解析が、さらに高効率で実現しました。

　次に、電子線三次元結晶構造解析のために、タンパク質、ペプチド、機能性有機材料、薬剤などのさまざまな試料の微小結晶の低倍率の像を機械学習させました。クライオEMの観察でコンタミネーションとしてよく見られる氷の結晶なども同定し、撮影から除外できるようにしました。さらに、これらの試料の回折パターン（図3左と中央）も同様に学習させ、学習結果を電子顕微鏡の制御ソフトに組み込みました。その結果、試料位置を外すことがなくなったと同時に、回転測定の前に結晶の品質を判定できるようになりました。また、低倍率（数百倍）の像から結晶位置を決定できるように学習させ、その場所を撮影候補のリストに登録できるようにもしました（図3右）。
　これにより、電子回折の三次元データ測定においても、ほぼ全自動で高品質なデータ取得が可能になりました。この開発も理研の高性能クライオEMにおいて運用し、高精度かつ高効率な微小結晶構造解析が実現しました。

　研究チームは、今回開発したシステムを「yoneoLocr（You Only Navigate Em Once to LOCate in Real time）」と名付け、自動撮影および関連スクリプトプログラム、手順とともにソースコードを公開しました^注3)。

注2） 2019年5月21日プレスリリース「タンパク質やその複合体の高分解能・高精度解析に成功」
　　http://www.riken.jp/pr/press/2019/ 20190521_1/
注3） https://github.com/YonekuraLab/yoneoLocr

今後の期待
　本研究では、ディープラーニングを利用して、クライオEMの単粒子解析と微小結晶からの電子回折データの自動測定を実現するyoneoLocrというソフトウェアを開発しました。これを用いることで、撮影の失敗がなくなり、人間の操作を必要とせずに高品質なデータ測定が実現できます。
　近年、クライオEMの単粒子解析と微小結晶の電子線三次元結晶構造解析は大きく注目されています。後者は生命科学に留まらず、合成化学、材料科学などでも利用が期待される技術です。今回開発したソフトウェアと測定技術により、今後、幅広い分野での応用研究を進めていきます。

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補足説明

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