病原菌はヘムを解毒して血中で増殖する
－敗血症や髄膜炎の薬剤開発に貢献する膜タンパク質の解析－

2022年6月28日
理化学研究所
兵庫県立大学

理化学研究所（理研）生命機能科学研究センタータンパク質機能・構造研究チームの中村寛夫特別嘱託研究員、久野玉雄専任研究員、白水美香子チームリーダー、兵庫県立大学大学院理学研究科の城宜嗣特命教授、マフーズ・ラーマン大学院生らの共同研究グループは、病原菌（グラム陽性細菌[1]）にとって有毒となる宿主由来のヘム[2]を排出する膜タンパク質「ABCトランスポーター[3]」の仕組みを解明しました。 　本研究成果は、タンパク質立体構造や酵素活性に基づいてヘム排出能を制御する低分子化合物の設計やスクリーニングを可能にし、ヒト血中でのグラム陽性細菌の増殖を阻害する薬剤の開発に貢献すると期待できます。 　敗血症や髄膜炎は細菌やウィルスなどの微生物感染によって引き起こされます。これら感染源となる細菌のうち、黄色ブドウ球菌や連鎖球菌は外膜を持たないグラム陽性細菌に属し、宿主血中で増殖する際に生じる「遊離ヘム[2]」に細胞膜がさらされるために、過剰なヘムを細胞外に排出して解毒する機能を持つと考えられています。その機能を担う候補であるABCトランスポーターの遺伝子は発見されたものの、タンパク質レベルでのヘム排出の仕組みは未解明のままでした。 　今回、共同研究グループは、膜タンパク質としてのABCトランスポーターの生化学的な解析と、大型放射光施設「SPring-8[4]」を用いた詳細なX線結晶構造解析[4]を行いました。その結果、このABCトランスポーターは、病原菌の細胞膜に侵入した遊離ヘムを捕捉し、続いて起こるATPの結合によって生じる構造変化により、ヘムを押し出す汲み出しポンプであることが分かりました。 　本研究は、科学雑誌『Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）』オンライン版に近日中に掲載されます。 　 　 論文情報 ＜タイトル＞ Structural basis for heme detoxification by an ATP-binding cassette–type efflux pump in gram-positive pathogenic bacteria ＜著者名＞ Hiro Nakamura, Tamao Hisano, Md. Mahfuzur Rahman, Takehiko Tosha, Mikako Shirouzu,　Yoshitsugu Shiro ＜雑誌＞ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS） ＜DOI＞ 10.1073/pnas.2123385119

背景
　鉄はほとんどの生物にとって必須の元素です。生物内の鉄の多くは、鉄イオンが環状の有機分子（ポルフィリン）に覆われたヘム（鉄プロトポルフィリンIX）として存在しています。私たちは、自分の細胞内で合成するヘムに加えて、食べ物に含まれる他の生物由来のヘムを消化・吸収したものを鉄源やヘム源として利用しています。これらのヘムはさまざまなタンパク質と結び付くことで、酸化還元反応や酸素運搬など生命活動に必須な生化学反応の多くを担っています。その代表例が、ヘムとグロビンタンパク質が結合したヘモグロビンです。一方で、タンパク質と結合していない遊離ヘムは活性酸素を産出するため細胞毒性をもつことも知られています。
　ヒトの体内に侵入した病原菌は、ヘモグロビンから鉄を含んだヘムを奪い取って血中で増殖しますが、ヘモグロビンを分解する際に高濃度の遊離ヘムにさらされます。一部の細菌（グラム陰性細菌^[1]）は有毒な遊離ヘムを過剰に取り込まないように細胞膜の外側にバリア（外膜）を備えています。一方、外膜を持たない細菌（グラム陽性細菌）は、細胞内からヘムを排出する仕組みを進化させたと考えられています。
　グラム陽性細菌の一種である黄色ブドウ球菌が持つhrtBA遺伝子^[5]は、ヘムによって発現が誘導される遺伝子として2006年に発見され、その遺伝子産物は「ATP-binding cassette（ABC）トランスポーター」と呼ばれる膜タンパク質の一つであることがアミノ酸配列の解析から判明しています。また、HrtBAタンパク質がグラム陽性細菌に固有のタンパク質であることも分かっています。ABCトランスポーターは全ての生物が持つ膜タンパク質でATP^[6]を使って物質を細胞内外に輸送する役割を担っています。hrtBA遺伝子を欠損した細菌は、ヒト血中に存在する遊離ヘム濃度に対しても感受性があることから、HrtBAタンパク質はグラム陽性細菌の細胞に侵入した過剰のヘムを排出するポンプであると推定されていました。しかし、HrtBAタンパク質はこれまでにタンパク質レベルで研究されておらず、ATPを使ってヘム排出する仕組みは不明のままでした（図１）。

研究手法と成果
　まず共同研究グループは、HrtBAタンパク質がヘムの解毒能を持つのかを検証しました。分子生物学研究に一般的に用いられる大腸菌実験室株K12はヘムを通さない外膜に包まれているため、ヘムに耐性を持っています（図2A上段）。この大腸菌に組換えDNA技術^[7]を用いて外来ヘムが細胞内に取り込まれるようにしたところ、増殖速度が低下したことから、ヘムがこの組換え大腸菌に対して有毒であることが確認できました（図2A中段）。このヘム感受性組換え大腸菌株にジフテリア菌由来のhrtBA遺伝子をさらに発現させたところ、増殖速度が回復しました。この結果から、HrtBAタンパク質が確かにヘムを解毒できることが分かりました（図2A下段）。
　次に、HrtBAタンパク質の膜タンパク質としての性質を調べるため、この組換え大腸菌細胞膜から界面活性剤存在下でHrtBAタンパク質を可溶化・精製した後、脂質ナノディスク^[8]に埋め戻すことで、HrtBAタンパク質だけが埋め込まれた擬似的な細胞膜を作製しました。こうして、ナノディスクに再構成したHrtBAタンパク質にヘムを添加したところ、HrtBAタンパク質のATP加水分解活性^[6]が促進されることを確認しました（図2B）。また、HrtBAタンパク質にヘムを結合させた状態でATPを添加すると、HrtBAタンパク質からヘムが遊離することも分かりました（図2C,D）。

　以上の結果から、HrtBAタンパク質はATPに依存してヘムとの結合状態を変化させていると考えられます。そこで、HrtBAタンパク質の立体構造を解析することで、この変化を詳細に調べることにしました。具体的には、ヘム結合型、ATPに類似した構造を持つATPアナログ^[6]（AMP-PNP）結合型、何も結合していないフリー型のHrtBAタンパク質の結晶を調製し、大型放射光施設「SPring-8」でＸ線による構造解析を行いました。
　これらの立体構造解析から、HrtBAタンパク質の膜横断ドメイン^[9]のヘム結合部位を明らかにするとともに、フリー型からヘム結合型への膜横断ドメインの構造変換およびATP加水分解酵素（ATPase）ドメインへのATP結合による膜ドメインの構造変換を視覚化することができました。ヘム結合部位は、細胞膜リン脂質二重膜の外葉表面付近にありました（図3B上段）。フリー型では、ヘム結合ドメインの膜横断ヘリックス^[9]が横にずれており、細胞膜外側表面に位置するグルタミン酸がタンパク質表面に露出していました（図3A中段）。フリー型からヘム結合型になるときには、鉄原子にグルタミン酸が配位し、4本の膜横断ヘリックスがヘムを挟むように再配置していました（図3B中段）。
　一方ATP結合型では、二つのATPase触媒部位にそれぞれATP（本実験ではAMP-PNP）が結合することで、触媒サブユニット同士が接触した二量体構造になっていました（図3C下段）。それに伴い、膜横断ドメインの4本の膜貫通ヘリックスが束ねられたバンドル構造となり、ヘム結合スペースが消失していました（図４）。

　
　

ヘムは水に溶けにくく油に溶けやすい脂溶性であることから、溶液中の遊離ヘムは容易に膜に侵入して膜構造を破壊したり、活性酸素種^[10]を作り出したりするなど有害な作用を及ぼします。共同研究グループは今回の実験データから、HrtBAタンパク質によるヘムの排出は細胞質から細胞膜を透過させるのではなく、細胞膜から汲み出す、次の三つの反応で進むと考えました。
① HrtBAタンパク質がATPと結合していないときに細胞膜に侵入したヘムと結合し、膜から抜き取る。
② ヘムと結合したHrtBAタンパク質にATPが結合すると、HrtBAタンパク質の膜横断ドメインの構造変換によって結合していたヘムを排出する。
③ HrtBAタンパク質のATP加水分解活性によってATPが分解される。
こうして③の状態まで進むとHrtBAタンパク質の構造は①に戻り、ヘム排出ポンプの機能がターンオーバーするというモデルが導き出されました（図5）。

今後の期待
　グラム陽性細菌である黄色ブドウ球菌や連鎖球菌の血中での増殖は、敗血症や髄膜炎など重篤な病気を引き起こします。HrtBAタンパク質のヘム排出能を制御する薬剤は、これら病原菌の血中での増殖を抑制する働きが期待されることから、今回明らかになった構造情報を基にした薬剤のデザインや、機能解析に基づく薬剤スクリーニングは、新しい薬剤開発に貢献すると期待できます。

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補足説明

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共同研究グループ
理化学研究所
　生命機能科学研究センター　タンパク質機能・構造研究チーム
　　特別嘱託研究員　中村　寛夫　（ナカムラ・ヒロオ）
　　専任研究員　久野　玉雄　（ヒサノ・タマオ）
　　チームリーダー　白水　美香子　（シロウズ・ミカコ）
　放射光科学研究センター　生命系放射光利用システム開発チーム
　　専任研究員　當舎　武彦　（トウシャ・タケヒコ）
兵庫県立大学　大学院理学研究科　生命科学専攻
　　特命教授　城　宜嗣　（シロ・ヨシツグ）
　　大学院生　マフーズ・ラーマン（Md. Mahfuzur Rahman）

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研究支援
　本研究は、理化学研究所運営費交付金（生命機能科学研究）理化学研究所奨励課題「ヘムは栄養となるのか？毒となるのか？：ヘム毒性を解毒する病原菌のヘム排出ポンプの研究（研究代表者：中村寛夫）」、RIKEN Pioneering Projects「Dynamic Structural Biology by Integrating Physics, Chemistry, and Computational Science Research（研究分担者：白水美香子）」、RIKEN Pioneering Projects「Molecular Systems Research（研究分担者：城宜嗣）」で実施し、日本学術振興会（JSPS）科学研究費補助金基盤研究（C）「ヘムを解毒する病原菌のヘム排出ポンプの構造・機能解析（研究代表者：中村寛夫）」、同基盤研究（C）「ジフテリア菌ヘムセンサーのヘム受容の分子機序（研究代表者：中村寛夫）」、同基盤研究（S）「一酸化窒素の生体内動態の分子科学（研究代表者：城宜嗣）」による支援を受けて行われました。

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